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Mar 24, 2023

Un ultra

Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 16518 (2022) Citer cet article

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Détails des métriques

Un spectromètre à neuf couleurs ultra-petit (54 × 58 × 8,5 mm) et à grande ouverture (1 × 7 mm) - utilisant un réseau de dix miroirs dichroïques "biparties" en deux couches - a été développé et utilisé pour l'imagerie spectrale instantanée. Le flux de lumière incidente avec une section transversale inférieure à la taille de l'ouverture est divisé en neuf flux de couleur avec des bandes de longueur d'onde contiguës de 20 nm de largeur et des longueurs d'onde centrales de 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 et 690 nm. Les images des neuf flux de couleur sont mesurées simultanément et efficacement par un capteur d'image. Contrairement à un réseau de miroirs dichroïques conventionnel, le réseau de miroirs dichroïques développé a une configuration unique en deux parties qui non seulement augmente le nombre de couleurs pouvant être mesurées simultanément, mais améliore également la résolution d'image de chaque flux de couleur. Le spectromètre à neuf couleurs développé a été utilisé pour l'électrophorèse à quatre capillaires. Huit colorants migrant simultanément dans chaque capillaire ont été quantifiés simultanément par détection de fluorescence induite par laser à neuf couleurs. Étant donné que le spectromètre à neuf couleurs est non seulement ultra-petit et peu coûteux, mais qu'il a également un débit lumineux élevé et une résolution spectrale suffisante pour la plupart des applications d'imagerie spectrale, il a le potentiel d'être largement utilisé dans divers domaines.

L'imagerie hyperspectrale et multispectrale est devenue une technologie indispensable dans des domaines1 tels que l'astronomie2, la télédétection pour l'observation de la Terre3,4, le contrôle de la qualité des aliments et de l'eau5,6, la conservation de l'art et l'archéologie7, la médecine légale8, la chirurgie9 et les tests et diagnostics biomédicaux10,11 ,12,13. Les méthodes de mesure du spectre de la lumière émise à partir de chaque point d'émission dans le champ de vision sont classées comme (1) balayage ponctuel ("whisk-broom")14,15, (2) balayage linéaire ("push-broom")16 ,17,18, (3) balayage de longueur d'onde19,20,21 et (4) instantané22,23,24,25. Dans le cas de toutes ces méthodes, la résolution spatiale, la résolution spectrale et la résolution temporelle partagent une relation de compromis9,10,12,26. De plus, le débit lumineux a un effet significatif sur la sensibilité, à savoir le rapport signal sur bruit dans l'imagerie spectrale26. Le débit lumineux, à savoir l'efficacité d'utilisation de la lumière, est proportionnel au rapport de la quantité de lumière réellement mesurée à la quantité totale de lumière dans la bande de longueur d'onde à mesurer émise à partir de chaque point d'émission par unité de temps. Lorsque l'intensité ou le spectre de la lumière émise à partir de chaque point d'émission change dans le temps, ou lorsque la position de chaque point d'émission change dans le temps, la catégorie (4) est la méthode appropriée car les spectres des lumières émises à partir de tous les points d'émission sont mesurés simultanément24.

La plupart des méthodes mentionnées ci-dessus sont combinées avec des spectromètres volumineux, compliqués et/ou coûteux utilisant des réseaux18 ou des prismes14,16,22,23 pour les catégories (1), (2) et (4) ou des roues à filtres20,21, liquide –des filtres accordables à cristaux (LCTF)25, ou des filtres accordables acousto-optiques (AOTF)19 pour la catégorie (3). En revanche, les spectromètres utilisant plusieurs miroirs dichroïques pour la catégorie (4) sont petits et peu coûteux grâce à leur configuration simple27,28,29,30. De plus, ils ont un débit lumineux élevé car les deux lumières séparées par chaque miroir dichroïque (c'est-à-dire la lumière transmise et la lumière réfléchie de la lumière incidente sur chaque miroir dichroïque) sont pleinement et continuellement utilisées. Cependant, le nombre de bandes de longueurs d'onde (c'est-à-dire de couleurs) à mesurer simultanément est limité à environ quatre26.

L'imagerie spectrale basée sur la détection de fluorescence est souvent utilisée pour l'analyse multiplex dans les tests biomédicaux et le diagnostic10,13. Dans l'analyse multiplex, étant donné que plusieurs types d'analytes (par exemple, des ADN ou des protéines spécifiques) sont respectivement marqués avec différents colorants fluorescents, la quantité de chaque analyte présente à chaque point d'émission dans le champ de vision à chaque instant est quantifiée par une analyse à plusieurs composants, c'est-à-dire , démixant le spectre détecté des fluorescences émises à partir de chaque point d'émission à chaque instant31,32. Au cours de cette procédure, différents colorants, chacun émettant une fluorescence différente, peuvent co-localiser, c'est-à-dire coexister dans l'espace et dans le temps. Le nombre maximum actuel de colorants pouvant être excités par un seul faisceau laser pour que chaque colorant se distingue des autres est de huit33. Cette limite supérieure n'est pas déterminée par la résolution spectrale (c'est-à-dire le nombre de couleurs) mais par les largeurs des spectres de fluorescence (≥ 50 nm) et les amplitudes des décalages de Stokes (≤ 200 nm) des colorants lors du transfert d'énergie de résonance de fluorescence ( FRET)10 est utilisé. Cependant, le nombre de couleurs doit être supérieur ou égal au nombre de colorants afin de démélanger les recouvrements spectraux des colorants31,32. Il est donc nécessaire d'augmenter le nombre de couleurs mesurées simultanément à huit ou plus.

Récemment, un spectromètre ultra-petit à sept couleurs (utilisant un réseau de sept miroirs dichroïques et un capteur d'image pour mesurer quatre flux de fluorescence) a été développé31. Le spectromètre est deux à trois ordres de grandeur plus petit qu'un spectromètre conventionnel utilisant un réseau ou un prisme34,35. Cependant, il est difficile de disposer plus de sept miroirs dichroïques dans un spectromètre et de mesurer simultanément plus de sept couleurs36,37. Au fur et à mesure que le nombre de miroirs dichroïques augmente, la différence maximale dans les longueurs de trajet optique des flux de couleur divisés augmente, et il devient difficile d'imager tous les flux sur le même plan de capteur. La longueur de chemin optique la plus longue des flux augmente également, de sorte que la largeur d'ouverture du spectromètre (à savoir, la largeur maximale de la lumière analysée par le spectromètre) diminue.

En réponse aux problèmes décrits ci-dessus, dans cette étude, un spectromètre à neuf couleurs ultra-petit - utilisant un réseau de dix miroirs dichroïques "biparted" à deux couches et un capteur d'image - pour l'imagerie spectrale instantanée [catégorie (4) ] était développé. Le spectromètre développé a une différence de longueur de chemin optique maximale plus petite et une longueur de chemin optique plus longue plus courte que celles du spectromètre précédent31. Il a été appliqué à l'électrophorèse à quatre capillaires pour détecter la fluorescence induite par laser à neuf couleurs, et huit colorants migrant simultanément dans chaque capillaire ont été quantifiés simultanément. Étant donné que le spectromètre développé est non seulement ultra-petit et peu coûteux, mais qu'il a également un débit lumineux élevé et une résolution spectrale suffisante pour la plupart des applications d'imagerie spectrale, il peut être largement utilisé dans divers domaines.

Un spectromètre conventionnel à neuf couleurs est illustré sur la figure 1a. Sa conception suit la conception du précédent spectromètre ultra-petit à sept couleurs31. Il est composé de neuf miroirs dichroïques disposés horizontalement et inclinés à 45° vers la droite, et un capteur d'image (S) est situé au-dessus des neuf miroirs dichroïques. Un flux entrant (C0) par le bas est divisé par le réseau de neuf miroirs dichroïques en neuf flux de couleur sortants (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9) vers le haut. Les neuf flux de couleur sont directement entrés dans le capteur d'image et détectés simultanément. Dans cette étude, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9 sont dans l'ordre des longueurs d'onde et sont représentés respectivement en magenta, violet, bleu, cyan, vert, jaune, orange, rouge orange et rouge. . Bien que ces indications de couleur soient utilisées tout au long de cet article, comme le montre la figure 3, elles diffèrent des couleurs réellement observées par l'œil humain.

Diagrammes schématiques de spectromètres conventionnels et nouveaux à neuf couleurs. ( a ) Spectromètre conventionnel à neuf couleurs avec réseau de neuf miroirs dichroïques. ( b ) Nouveau spectromètre à neuf couleurs avec réseau de dix miroirs dichroïques bipartites à deux couches. Le flux lumineux incident C0 est divisé en neuf flux lumineux de couleur C1-C9 et détecté par le capteur d'image S.

Le nouveau spectromètre à neuf couleurs développé avec un réseau de dix miroirs dichroïques à deux couches et un capteur d'image est illustré sur la figure 1b. Sur la couche inférieure, cinq miroirs dichroïques sont inclinés à 45° vers la droite et disposés du centre du réseau de dix miroirs dichroïques vers la droite. Sur la couche supérieure, les cinq autres miroirs dichroïques sont inclinés à 45° vers la gauche et disposés du centre vers la gauche. Le miroir dichroïque le plus à gauche sur la couche inférieure et le miroir dichroïque le plus à droite sur la couche supérieure se chevauchent. Un flux entrant (C0) par le bas est divisé en quatre flux de couleur sortants (C1-C4) par les cinq miroirs dichroïques de droite et cinq flux de couleur sortants (C5-C9) par les cinq miroirs dichroïques de gauche. D'une manière similaire au spectromètre conventionnel à neuf couleurs, les neuf flux de couleur sont directement entrés dans le capteur d'image (S) et détectés simultanément. La comparaison des figures 1a et b montre que dans le cas du nouveau spectromètre à neuf couleurs, la différence maximale des longueurs de trajet optique et la longueur de trajet optique la plus longue des neuf flux de couleur sont réduites de moitié.

La conception détaillée du réseau de dix miroirs dichroïques bipartites à deux couches - avec une taille ultra-petite de 29 mm (largeur) × 31 mm (profondeur) × 6 mm (hauteur) - est illustrée à la Fig. 2. Les dix - Le réseau de miroirs dichroïques est composé de cinq miroirs dichroïques (M1-M5) à droite et de cinq miroirs dichroïques (M6-M9 et un autre M5) à gauche, chacun fixé sur un support en aluminium. Tous les miroirs dichroïques sont disposés par étapes pour compenser le déplacement parallèle des flux dû à la réfraction lorsque les flux traversent les miroirs31. Un filtre passe-bande (BP) est fixé en dessous de M1. La taille de M1 et BP est de 10 mm (côté long) × 1,9 mm (côté court) × 0,5 mm (épaisseur). Celle des autres miroirs dichroïques est de 15 mm × 1,9 mm × 0,5 mm. L'intervalle de réseau entre M1 et M2 est de 1,7 mm et l'intervalle de réseau des autres miroirs dichroïques est de 1,6 mm. Le flux entrant C0 et les neuf flux de couleur C1-C9 divisés par le réseau de dix miroirs dichroïques sont superposés sur la figure 2c.

Conception d'un réseau de dix miroirs dichroïques bipartites à deux couches. ( a ) Perspective et ( b ) vues en coupe transversale du réseau de dix miroirs dichroïques bipartites à deux couches (avec une taille de 29 mm × 31 mm × 6 mm). Il se compose de cinq miroirs dichroïques (M1-M5) disposés sur la couche inférieure, de cinq miroirs dichroïques (M6-M9 et un autre M5) disposés sur la couche supérieure et d'un filtre passe-bande (BP) sous M1. ( c ) Vue en coupe transversale dans la direction perpendiculaire, avec C0 et C1-C9 superposés.

La largeur d'ouverture dans la direction horizontale, indiquée par la largeur de C0 sur la figure 2c, est de 1 mm, et celle dans la direction perpendiculaire au plan de la figure 2c, spécifiée par la conception du support en aluminium, est de 7 mm. C'est-à-dire que le nouveau spectromètre à neuf couleurs a une grande ouverture de 1 mm × 7 mm. La longueur du chemin optique de C4 est la plus longue parmi C1-C9, et la longueur du chemin optique de C4 à l'intérieur du réseau à dix miroirs dichroïques spécifié par la taille ultra-petite mentionnée ci-dessus (29 mm × 31 mm × 6 mm) est de 12 mm. Pendant ce temps, la longueur du chemin optique de C5 est la plus courte parmi C1-C9, et la longueur du chemin optique de C5 est de 5,7 mm. La différence maximale des longueurs de chemin optique est donc de 6,3 mm. Les longueurs de chemin optique ci-dessus sont corrigées pour l'extension des longueurs optiques par transmission de lumière à travers M1-M9 et BP (en quartz).

Les caractéristiques spectrales de M1−M9 et BP ont été conçues pour que les flux C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9 aient des plages de longueurs d'onde de 520–540, 540–560, 560–580, 580–600 , 600–620, 620–640, 640–660, 660–680 et 680–700 nm, respectivement.

Une photographie du réseau de dix miroirs dichroïques fabriqué est illustrée à la Fig. 3a. M1−M9 et BP sont respectivement collés sur des pentes à 45° et le plan horizontal du support en aluminium, bien que M1 et BP soient masqués au verso de la figure.

Réseau de dix miroirs dichroïques fabriqués et ses démonstrations. (a) Réseau de dix miroirs dichroïques fabriqué. ( b ) Images fractionnées en neuf couleurs, avec des tailles de 1 mm × 7 mm, projetées sur une feuille de papier placée devant le réseau de dix miroirs dichroïques et éclairées par une lumière blanche par l'arrière. (c) Réseau de dix miroirs dichroïques éclairé par une lumière blanche par l'arrière. ( d ) Flux divisés à neuf couleurs émis par le réseau de dix miroirs dichroïques, observés en plaçant un réservoir acrylique rempli de fumée devant le réseau de dix miroirs dichroïques en c et en assombrissant la pièce.

Les spectres de transmission mesurés de M1 − M9 pour C0 à des angles d'incidence de 45 ° et BP pour C0 à un angle d'incidence de 0 ° sont illustrés à la Fig. 4a. Les spectres de transmission de C1-C9 par rapport à C0 sont illustrés à la Fig. 4b. Ces spectres ont été calculés à partir des spectres de la Fig. 4a sur la base des chemins optiques de C1 à C9 des Figs. 1b et 2c. Par exemple, TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)], et TS(C9 ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)], où TS(X) et [1 - TS(X)] sont respectivement les spectres de transmission et de réflexion de X. Comme le montre la Fig. 4b, les bandes de transmission (transmission ≥ 50 %) de C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 , et C9 sont 521–540, 541–562, 563–580, 581–602, 603–623, 624–641, 642–657, 659–680 et 682–699 nm, respectivement. Ces résultats sont cohérents avec les bandes de longueur d'onde conçues. De plus, l'efficacité d'utilisation de la lumière de C0 est élevée, c'est-à-dire que la transmission maximale moyenne de C1 à C9 est de 92 %.

Spectres de transmission de miroirs dichroïques et de flux à neuf couleurs divisés. ( a ) Spectres de transmission mesurés de M1 − M9 à des angles d'incidence de 45 ° et BP à un angle d'incidence de 0 °. ( b ) Spectres de transmission de C1 à C9 par rapport à C0 calculés à partir de ( a ).

Sur la figure 3c, le réseau de dix miroirs dichroïques est positionné verticalement de sorte que son côté droit sur la figure 3a soit le côté supérieur et qu'un flux de lumière blanche LED collimaté (C0) soit éclairé par l'arrière. Le réseau de dix miroirs dichroïques illustré à la Fig. 3a est maintenu à l'intérieur d'un adaptateur d'une taille de 54 mm (hauteur) × 58 mm (profondeur) × 8,5 mm (épaisseur). Sur la figure 3d, en plus de l'état illustré sur la figure 3c, un réservoir en acrylique rempli de fumée est placé devant le réseau de dix miroirs dichroïques et la lumière ambiante est éteinte. En conséquence, neuf flux de séparation de couleur émis par le réseau de dix miroirs dichroïques sont visibles dans le réservoir. Chaque flux divisé a une section transversale rectangulaire d'une taille de 1 × 7 mm, ce qui correspond à la taille d'ouverture du nouveau spectromètre à neuf couleurs. Sur la Fig. 3b, un morceau de papier est placé devant le réseau de dix miroirs dichroïques de la Fig. 3c et des images de 1 x 7 mm des neuf flux de séparation de couleur projetés sur le papier sont observées à partir de la direction de déplacement du flux divisés en neuf couleurs. Les neuf flux de séparation de couleur sur les Fig. 3b et d sont C4, C3, C2, C1, C5, C6, C7, C8 et C9 dans l'ordre de haut en bas, comme on le comprend également à partir des Fig. 1b et 2c. Ceux-ci sont observés dans des couleurs correspondant à leurs longueurs d'onde respectives. Étant donné que l'intensité de la lumière blanche LED (voir Fig. S3 supplémentaire) et la sensibilité de la caméra couleur utilisée pour prendre des photos sur la Fig. 3 en ce qui concerne C9 (682–699 nm) sont toutes deux faibles, l'intensité observée de C9 (le flux en bas) est plus faible que celle des autres flux fractionnés. De même, C9 a été faiblement observé à l'œil nu. Pendant ce temps, C2 (le deuxième flux à partir du haut) semble vert sur la Fig. 3, mais semble plus jaune à l'œil nu.

La progression de la Fig. 3c à d est illustrée dans la vidéo supplémentaire 1. Immédiatement après la transmission du flux de lumière blanche LED à travers le réseau de dix miroirs dichroïques, il est simultanément divisé en neuf flux de couleur. Finalement, la fumée dans le réservoir disparaît progressivement du haut vers le bas du réservoir, de sorte que les neuf flux de séparation de couleur disparaissent également dans l'ordre du haut vers le bas. Au contraire, dans la vidéo supplémentaire 2, lorsque la longueur d'onde du flux lumineux incident sur le réseau de dix miroirs dichroïques est modifiée séquentiellement de long à court dans l'ordre 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 , et 532 nm, seul le flux de séparation de couleur correspondant parmi les neuf flux de séparation de couleur est visualisé dans l'ordre C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 et C1. Le réservoir en acrylique a été remplacé par une cellule en quartz afin qu'il soit possible d'observer clairement la forme de la feuille de chaque flux divisé en diagonale au-dessus. De plus, la vidéo supplémentaire 3 est montée de manière à ce que la partie de changement de longueur d'onde de la vidéo supplémentaire 2 soit reproduite de manière répétée. C'est l'expression la plus éloquente des caractéristiques du réseau de dix miroirs dichroïques.

Les résultats décrits ci-dessus montrent que le réseau de dix miroirs dichroïques fabriqué, ou le nouveau spectromètre à neuf couleurs, fonctionne comme prévu. Le nouveau spectromètre à neuf couleurs a été formé en montant le réseau de dix miroirs dichroïques avec l'adaptateur directement sur une carte de capteur d'image.

Les flux lumineux avec une bande de longueur d'onde de 400 à 750 nm, émis à partir de quatre points d'émission de ϕ50-μm disposés à des intervalles de 1 mm dans la direction perpendiculaire au plan de la Fig. 2c, ont été respectivement collimatés par le réseau de quatre lentilles utilisé dans le étude précédente31,34. Le réseau à quatre lentilles se compose de quatre lentilles ϕ1 mm avec des longueurs focales de 1,4 mm et des intervalles de 1 mm. Les quatre flux collimatés (quatre C0) disposés à des intervalles de 1 mm étaient incidents sur BP du nouveau spectromètre à neuf couleurs. Chaque flux (C0) a été divisé en neuf flux de couleur (C1-C9) par le réseau de dix miroirs dichroïques. Les trente-six flux résultants (quatre ensembles de C1-C9) ont ensuite été directement entrés dans un capteur d'image CMOS (S) directement attaché au réseau de dix miroirs dichroïques. En conséquence, comme le montre la figure 5a, toutes les images des trente-six flux ont été simultanément et clairement détectées dans une taille uniforme en raison à la fois de la faible différence de longueur de chemin optique maximale et de la courte longueur de chemin optique maximale. En fonction du spectre des flux incidents (voir Fig. S4 supplémentaire), les intensités d'image des quatre ensembles de C1, C2 et C3 sont relativement faibles. La taille des trente-six images est de 0,57 ± 0,05 mm (moyenne ± écart type). Le grossissement de l'image est donc de 11,4 en moyenne. L'intervalle d'image vertical est de 1 mm (le même que l'intervalle de lentille-matrice) et l'intervalle d'image horizontal est de 1,6 mm (le même que l'intervalle dichroïque-miroir-matrice) en moyenne. La taille d'image étant ainsi suffisamment inférieure aux intervalles d'image, chaque image peut être mesurée indépendamment (avec une faible diaphonie). Pendant ce temps, des images de vingt-huit flux détectés par le spectromètre conventionnel à sept couleurs utilisé dans notre étude précédente31 sont présentées sur la figure 5b. Le réseau à sept miroirs dichroïques a été créé en supprimant les deux miroirs dichroïques à l'extrême droite du réseau à neuf miroirs dichroïques de la Fig. 1a. Toutes les images ne sont pas nettes et la taille des images augmente de C1 à C7. La taille des vingt-huit images est de 0,70 ± 0,19 mm. Il est donc difficile de maintenir une haute résolution d'imagerie dans toutes les images. Le coefficient de variation (CV) de la taille des vingt-huit images de la figure 5b est de 28 %, tandis que celui de la taille des trente-six images de la figure 5a est réduit à 9 %. Les résultats décrits ci-dessus clarifient le fait que le nouveau spectromètre à neuf couleurs a non seulement augmenté le nombre de couleurs mesurées simultanément de sept à neuf mais a également obtenu une résolution d'imagerie élevée pour chaque couleur.

Comparaison des qualités des images fractionnées formées par les spectromètres conventionnels et nouveaux. ( a ) Quatre ensembles d'images fractionnées en neuf couleurs (C1-C9) formées par le nouveau spectromètre à neuf couleurs. (b) Quatre ensembles d'images fractionnées en sept couleurs (C1-C7) formées par le spectromètre conventionnel à sept couleurs. Les flux (C0) avec une longueur d'onde de 400 à 750 nm provenant de quatre points d'émission ont été respectivement collimatés et incidents sur chaque spectromètre.

Les performances spectroscopiques du spectromètre à neuf couleurs ont été évaluées expérimentalement et les résultats de l'évaluation sont présentés sur la figure 6. Notez que la figure 6a montre le même résultat que la figure 5a; c'est-à-dire que lorsque chacun des quatre C0 avait une longueur d'onde de 400 à 750 nm, les trente-six images (les quatre ensembles de C1 - C9) ont été détectées. Au contraire, comme le montre la figure 6b-j, lorsque chaque C0 avait une longueur d'onde spécifique de 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 ou 690 nm, presque seulement quatre images correspondantes (quatre ensembles de C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 ou C9) ont été détectés. Cependant, certaines images adjacentes aux quatre images correspondantes ont été très faiblement détectées, car les spectres de transmission de C1-C9 illustrés à la Fig. 4b se chevauchent légèrement et chaque C0 de la longueur d'onde spécifique a une bande de longueur d'onde de 10 nm comme décrit dans Méthodes. Ces résultats sont cohérents avec les spectres de transmission de C1-C9 illustrés à la Fig. 4b et aux vidéos supplémentaires 2 et 3. En d'autres termes, le spectromètre à neuf couleurs fonctionne comme prévu à partir des résultats illustrés à la Fig. 4b. On en conclut donc que le profil d'intensité d'image de C1-C9 représente le spectre lumineux de chaque C0.

Performances spectroscopiques du spectromètre à neuf couleurs. Quatre ensembles d'images divisées en neuf couleurs (C1−C9) formées par le nouveau spectromètre à neuf couleurs lorsque les lumières incidentes (quatre C0) sont des lumières avec des longueurs d'onde de (a) 400−750 nm (comme sur la Fig. 5a), (b ) 530 nm, (c) 550 nm, (d) 570 nm, (e) 590 nm, (f) 610 nm, (g) 630 nm, (h) 650 nm, (i) 670 nm et (j) 690 nm, respectivement.

Le spectromètre à neuf couleurs développé a été appliqué à l'électrophorèse à quatre capillaires (voir le matériel supplémentaire pour plus de détails)31,34,35. Le réseau à quatre capillaires se compose de quatre capillaires (avec des diamètres extérieurs de 360 ​​μm et des diamètres intérieurs de 50 μm) disposés à des intervalles de 1 mm aux positions d'irradiation laser. Un échantillon contenant des fragments d'ADN marqués avec huit types de colorants, à savoir FL-6C (Dye1), JOE-6C (Dye2), dR6G (Dye3), TMR-6C (Dye4), CXR-6C (Dye5), TOM-6C (Dye6), LIZ (Dye7) et WEN (Dye8) dans l'ordre croissant de la longueur d'onde d'émission de fluorescence, ont été séparés dans chacun des quatre capillaires (ci-après, Cap1, Cap2, Cap3 et Cap4). Les fluorescences induites par laser de Cap1-Cap4 ont été collimatées par le réseau à quatre lentilles et détectées simultanément par le spectromètre à neuf couleurs. Les évolutions temporelles des intensités de fluorescence à neuf couleurs (C1 à C9) pendant l'électrophorèse, c'est-à-dire un électrophérogramme à neuf couleurs pour chaque capillaire, sont illustrées à la Fig. 7a. Des électrophérogrammes équivalents à neuf couleurs ont été obtenus dans Cap1-Cap4. Comme indiqué par les flèches sur la figure 7a pour Cap1, huit pics dans chaque électrophérogramme à neuf couleurs montrent respectivement les émissions de fluorescence individuelles de Dye1-Dye8.

Quantification simultanée à huit colorants par un spectromètre à neuf couleurs utilisé pour l'électrophorèse à quatre capillaires. ( a ) Électrophérogramme à neuf couleurs (C1-C9) pour chaque capillaire. Huit pics indiqués par des flèches pour Cap1 montrent l'émission de fluorescence individuelle de huit colorants (Dye1-Dye8). Les couleurs des flèches correspondent à celles de (b) et (c). ( b ) Spectres de fluorescence de huit colorants (Dye1-Dye8) pour chaque capillaire. c Électrophérogramme à huit colorants (Dye1-Dye8) pour chaque capillaire. Les pics de fragments d'ADN marqués par Dye7 sont indiqués par des flèches avec leurs longueurs de base pour Cap4.

Les distributions d'intensité de C1-C9 aux huit pics sont respectivement illustrées à la Fig. 7b. Étant donné que C1-C9 et Dye1-Dye8 sont tous deux dans l'ordre des longueurs d'onde, les huit distributions de la figure 7b montrent les spectres de fluorescence de Dye1-Dye8 dans l'ordre de gauche à droite. Dans cette étude, Dye1, Dye2, Dye3, Dye4, Dye5, Dye6, Dye7 et Dye8 sont représentés respectivement en magenta, violet, bleu, cyan, vert, jaune, orange et rouge. Notez que les couleurs des flèches sur la figure 7a correspondent aux couleurs des colorants sur la figure 7b. Les intensités de fluorescence de C1 à C9 pour chaque spectre de la figure 7b sont normalisées de sorte que leur sommation soit un. Huit spectres de fluorescence équivalents sont obtenus par Cap1-Cap4. Les chevauchements spectraux de fluorescence entre Dye1-Dye8 sont clairement observés.

Comme le montre la Fig. 7c, pour chaque capillaire, l'électrophérogramme à neuf couleurs de la Fig. 7a a été converti en un électrophérogramme à huit colorants par analyse multicomposant31 basée sur les huit spectres de fluorescence de la Fig. 7b (voir Matériel supplémentaire pour plus de détails). Étant donné que les chevauchements spectraux de fluorescence sur la figure 7a n'apparaissent pas sur la figure 7c, il est possible d'identifier et de quantifier individuellement Dye1-Dye8 à chaque instant même si différentes quantités de Dye1-Dye8 émettent des fluorescences simultanément. Cela ne serait pas possible avec la détection conventionnelle à sept couleurs31 ; cependant, cela est possible grâce à la détection à neuf couleurs développée. Comme indiqué par les flèches sur la figure 7c pour Cap1, seuls les pics uniques d'émissions de fluorescence de Dye3 (bleu), Dye8 (rouge), Dye5 (vert), Dye4 (cyan), Dye2 (violet), Dye1 (magenta) et Dye6 (jaune) sont observés dans l'ordre chronologique comme prévu. Quant à l'émission de fluorescence de Dye7 (orange), en plus d'un seul pic indiqué par la flèche orange, plusieurs autres pics uniques sont observés. Ce résultat est dû au fait que l'échantillon contient des normes de taille, à savoir des fragments d'ADN marqués par Dye7 avec différentes longueurs de base. Comme indiqué sur la figure 7c pour Cap4, ces longueurs de base comprennent 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214 et 220 longueurs de base.

Les principales caractéristiques du spectromètre à neuf couleurs développé utilisant le réseau de dix miroirs dichroïques à deux couches sont sa petite taille et sa configuration simple. Étant donné que le réseau de dix miroirs dichroïques maintenu à l'intérieur de l'adaptateur illustré à la Fig. 3c est directement monté sur la carte du capteur d'image (voir les Fig. S1 et S2), la taille du spectromètre à neuf couleurs est la même que la taille de l'adaptateur, soit 54 × 58 × 8,5 mm (épaisseur). Cette taille ultra-petite est de deux à trois ordres de grandeur inférieure à la taille d'un spectromètre conventionnel utilisant un réseau ou un prisme. De plus, étant donné que le spectromètre à neuf couleurs est configuré de manière à ce que la lumière soit incidente perpendiculairement à la surface du capteur d'image, il est facile d'allouer de l'espace pour le spectromètre à neuf couleurs dans un système, tel qu'un microscope, un cytomètre en flux ou un analyseur d'électrophorèse à réseau capillaire, d'une manière qui miniaturise davantage le système. Pendant ce temps, les tailles des dix miroirs dichroïques et du filtre passe-bande utilisés dans le spectromètre à neuf couleurs ne sont que de 10 × 1,9 × 0,5 mm ou 15 × 1,9 × 0,5 mm. Par conséquent, plus de 100 de ces petits miroirs dichroïques et filtres passe-bande peuvent être découpés respectivement à partir de miroirs dichroïques et de filtres passe-bande de 60 mm carrés. Par conséquent, il est possible de fabriquer le réseau à dix miroirs dichroïques à faible coût.

Une autre caractéristique du spectromètre à neuf couleurs est son excellente performance spectroscopique. En particulier, il permet l'imagerie spectrale instantanée, c'est-à-dire l'acquisition simultanée d'images avec des informations spectrales. Un spectre continu dans la gamme de longueurs d'onde de 520 à 700 nm avec une résolution de 20 nm est obtenu pour chaque image. En d'autres termes, pour chaque image, les intensités lumineuses des neuf couleurs, c'est-à-dire les neuf bandes de longueur d'onde de 20 nm qui divisent uniformément la gamme de longueur d'onde de 520 à 700 nm, sont détectées. Il est possible d'ajuster la gamme de longueurs d'onde et chaque largeur des neuf bandes de longueurs d'onde en modifiant les caractéristiques spectrales des miroirs dichroïques et du filtre passe-bande. La détection à neuf couleurs est utile non seulement dans la mesure de la fluorescence par imagerie spectrale (comme décrit dans ce rapport), mais également dans de nombreuses autres applications générales utilisant l'imagerie spectrale. Bien que des centaines de couleurs puissent être détectées avec l'imagerie hyperspectrale, il a été constaté que plusieurs cibles dans le champ de vision peuvent être identifiées avec une précision suffisamment élevée dans de nombreuses applications, même si le nombre de couleurs à détecter est considérablement réduit38,39,40. Étant donné que la résolution spatiale, la résolution spectrale et la résolution temporelle partagent une relation de compromis dans l'imagerie spectrale, la réduction du nombre de couleurs peut améliorer la résolution spatiale et la résolution temporelle. Il permet également d'utiliser un spectromètre simple comme celui développé dans cette étude et de réduire encore la charge de calcul.

Dans cette étude, huit colorants ont été quantifiés simultanément par démixage spectral des spectres de fluorescence qui se chevauchent des huit colorants basés sur la détection à neuf couleurs. Jusqu'à neuf types de colorants qui coexistent dans le temps et dans l'espace peuvent également être quantifiés simultanément. Les avantages particuliers du spectromètre à neuf couleurs sont son débit lumineux élevé et sa grande ouverture (1 × 7 mm). Le réseau de dix miroirs dichroïques a une transmittance maximale de 92 % de la lumière incidente à partir de l'ouverture dans chacune des neuf bandes de longueur d'onde. L'efficacité d'utilisation de la lumière incidente dans la gamme de longueurs d'onde de 520 à 700 nm est de presque 100 %. Dans une plage de longueurs d'onde aussi large, une telle efficacité d'utilisation élevée ne peut pas être obtenue avec n'importe quel type de réseau de diffraction. Même si le réseau de diffraction a une efficacité de diffraction supérieure à 90 % à une longueur d'onde spécifique, l'efficacité de diffraction à une autre longueur d'onde diminue à mesure que la différence entre cette longueur d'onde et la longueur d'onde spécifique augmente41. La largeur d'ouverture dans la direction perpendiculaire au plan de la Fig. 2c peut être étendue de 7 mm à la largeur d'un capteur d'image, par exemple 13 mm dans le cas du capteur d'image utilisé dans cette étude, en modifiant légèrement la conception de le réseau de dix miroirs dichroïques.

Le spectromètre à neuf couleurs peut être appliqué non seulement à l'électrophorèse capillaire, comme le montre cette étude, mais également à diverses autres applications. Par exemple, comme indiqué ci-dessous, le spectromètre à neuf couleurs peut être appliqué à un microscope à fluorescence. Un plan d'échantillon est imagé sur le capteur d'image du spectromètre à neuf couleurs par une lentille d'objectif 10 ×. La distance optique entre l'objectif et le capteur d'image est de 200 mm, tandis que la distance optique entre la surface incidente du spectromètre à neuf couleurs et le capteur d'image n'est que de 12 mm. Par conséquent, l'image est approximativement découpée au niveau de la surface incidente à la taille d'ouverture (1 × 7 mm) et est divisée en neuf images couleur. C'est-à-dire qu'il est possible d'effectuer une imagerie spectrale instantanée à neuf couleurs d'une région d'une taille de 0,1 × 0,7 mm sur le plan de l'échantillon. De plus, en balayant l'échantillon par rapport à la lentille d'objectif dans la direction horizontale de la figure 2c, une imagerie spectrale à neuf couleurs d'une zone plus grande sur le plan de l'échantillon est possible.

Les composants du réseau à dix miroirs dichroïques, c'est-à-dire M1-M9 et BP, ont été fabriqués sur mesure par Asahi Spectra Co., Ltd. en utilisant des techniques de dépôt standard. Plusieurs couches minces du matériau diélectrique ont été respectivement déposées sur dix plaques de quartz de 60 × 60 mm d'épaisseur de 0,5 mm pour répondre aux spécifications suivantes : M1 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 520–590 nm, Tave ≥ 90 % à 610-700 nm ; M2 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 520–530 nm, Tave ≥ 90 % à 550–600 nm ; M3 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 540–550 nm, Tave ≥ 90 % à 570–600 nm ; M4 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 560–570 nm, Tave ≥ 90 % à 590–600 nm ; M5 : IA = 45°, R ≥ 98 % à 580–600 nm, R ≥ 98 % à 680–700 nm ; M6 : IA = 45°, Tave ≥ 90 % à 600–610 nm, R ≥ 90 % à 630–700 nm ; M7 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 620–630 nm, Tave ≥ 90 % à 650–700 nm ; M8 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 640–650 nm, Tave ≥ 90 % à 670–700 nm ; M9 : IA = 45°, R ≥ 90 % à 650–670 nm, Tave ≥ 90 % à 690–700 nm ; BP : IA = 0°, T ≤ 0,01 % à 505 nm, Tave ≥ 95 % à 530–690 nm, T ≥ 90 % à 530–690 nm, T ≤ 1 % à 725–750 nm, où IA, T, Tave et R sont l'angle d'incidence, la transmission, la transmission moyenne et la réflexion de la lumière non polarisée.

La lumière blanche (C0) avec une gamme de longueurs d'onde de 400 à 750 nm émise par une source de lumière LED (AS 3000, AS ONE CORPORATION) a été collimatée et incidente verticalement sur BP du réseau de dix miroirs dichroïques. Le spectre de la lumière blanche LED est illustré à la Fig. S3 supplémentaire. Un réservoir en acrylique (d'une taille de 150 × 150 × 30 mm) a été placé juste devant le réseau de dix miroirs dichroïques, en face de BP. Ensuite, de la fumée produite en immergeant de la neige carbonique dans de l'eau a été versée dans le réservoir en acrylique pour visualiser les flux divisés à neuf couleurs de C1 à C9 émis par le réseau de dix miroirs dichroïques.

Alternativement, le flux de lumière blanche collimaté (C0) a été passé à travers un filtre avant d'être incident sur BP. Le filtre était initialement un filtre ND avec une DO de 0,6. Il a ensuite été remplacé par neuf filtres passe-bande de 10 nm avec des longueurs d'onde centrales de 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 et 532 nm en séquence à des intervalles de 5 s en utilisant une roue à filtres motorisée (FW212C, Thorlabs, Inc.). Enfin, le filtre ND a été remis en place. Les bandes de transmission des neuf filtres passe-bande correspondent à celles de C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 et C1, respectivement. Une cellule en quartz d'une taille interne de 40 (longueur optique) × 42,5 (hauteur) × 10 mm (largeur) a été placée juste devant le réseau de dix miroirs dichroïques, en face de BP. De la fumée a ensuite été fournie à la cellule de quartz via un tube afin que la concentration de fumée dans la cellule de quartz soit maintenue pour visualiser les flux divisés à neuf couleurs de C1 à C9 émis par le réseau de dix miroirs dichroïques.

Des vidéos des flux divisés en neuf couleurs émis par le réseau de dix miroirs dichroïques ont été tournées en mode time-lapse sur un iPhone XS. Les images de la scène ont été capturées à 1 image par seconde et les images ont été compilées pour créer les vidéos à 30 images par seconde (pour la vidéo supplémentaire 1) ou 24 images par seconde (pour les vidéos supplémentaires 2 et 3).

Une feuille d'acier inoxydable de 50 μm d'épaisseur (avec quatre trous d'épingle de ϕ50 μm à des intervalles de 1 mm) a été placée sur une plaque de diffusion. La lumière avec une bande de longueur d'onde de 400 à 750 nm, obtenue en faisant passer la lumière d'une lampe halogène à travers un filtre passe-bas avec une longueur d'onde de coupure de 700 nm, a été irradiée sur la plaque de diffusion. Le spectre de la lumière est illustré dans la Fig. S4 supplémentaire. Alternativement, la lumière a également été passée à travers l'un des filtres passe-bande de 10 nm avec des longueurs d'onde centrales de 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 et 690 nm et irradiée sur la plaque de diffusion. En conséquence, quatre points d'émission de ϕ50 μm avec différentes longueurs d'onde ont été formés sur la tôle d'acier inoxydable opposée à la plaque de diffusion.

Le réseau à quatre capillaires avec le réseau à quatre lentilles a été monté sur le spectromètre à neuf couleurs, comme indiqué sur les Fig. S1 et S2. Le réseau à quatre capillaires et le réseau à quatre lentilles sont les mêmes que ceux utilisés dans l'étude précédente31,34. Un faisceau laser de 505 nm d'une puissance de 15 mW a été simultanément et uniformément irradié sur les points d'émission des quatre capillaires depuis la direction latérale. La fluorescence émise à partir de chacun des points d'émission a été collimatée par la lentille correspondante et divisée en neuf flux de couleur par le réseau de dix miroirs dichroïques. Les trente-six flux résultants ont ensuite été directement entrés dans un capteur d'image CMOS (C11440–52U, Hamamatsu Photonics K·K.), et leurs images ont été simultanément détectées.

Pour chaque capillaire, un échantillon de 20 μl a été préparé en mélangeant 1 μl de PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation), 1 μl de A Mix dans ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), 4 μl de GeneScan™ 600 LIZ™ colorant Size Standard v2.0 (Thermo Fisher Scientific) et 14 μl d'eau. Le PowerPlex® 6C Matrix Standard comprend six fragments d'ADN marqués respectivement avec les six colorants FL-6C, JOE-6C, TMR-6C, CXR-6C, TOM-6C et WEN dans l'ordre de la longueur d'onde d'émission maximale. Les longueurs de base de ces fragments d'ADN ne sont pas divulguées, mais on sait que les fragments d'ADN marqués WEN, CXR-6C, TMR-6C, JOE-6C, FL-6C et TOM-6C sont dans l'ordre de la longueur de base. Le kit A Mix in ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit comprend un fragment d'ADN marqué avec le colorant dR6G. La longueur de base du fragment d'ADN n'est pas non plus divulguée. L'étalon de taille de colorant GeneScan™ 600 LIZ™ v2.0 comprend trente-six fragments d'ADN marqués avec le colorant LIZ. Les longueurs de base de ces fragments d'ADN sont 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 314, 320, 340, bases 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 et 600. L'échantillon a été dénaturé à 94 °C pendant 3 min et refroidi sur de la glace pendant 5 min. L'échantillon a été injecté dans chaque capillaire à 26 V/cm pendant 9 s, et séparé dans chaque capillaire rempli d'une solution de polymère POP-7™ (Thermo Fisher Scientific), avec une longueur effective de 36 cm, et à 181 V/cm et 60 °C.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses informations supplémentaires. Des données supplémentaires liées à cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions Yoshimitsu Yanagawa et Tomoyuki Sakai de Hitachi, Ltd. pour leurs précieux commentaires sur le manuscrit.

Groupe de recherche et développement, Hitachi Ltd., 1-280 Higashi-koigakubo, Kokubunji, Tokyo, 185-8601, Japon

Takashi Anazawa

Groupe commercial des solutions analytiques et médicales, Hitachi High-Tech Corporation, 882 Ichige, Hitachinaka, Ibaraki, 312-8504, Japon

Shuhei Yamamoto et Ryoji Inaba

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TA a inventé et développé le spectromètre, mené des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit. SY et RI ont discuté des résultats et examiné le manuscrit.

Correspondance à Takashi Anazawa.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Anazawa, T., Yamamoto, S. & Inaba, R. Un spectromètre à neuf couleurs ultra-petit avec un réseau de dix miroirs dichroïques bipartites à deux couches et un capteur d'image. Sci Rep 12, 16518 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20814-3

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Reçu : 10 mai 2022

Accepté : 19 septembre 2022

Publié: 03 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-20814-3

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